利用金属的平衡相图，确定不同要求的退火温度，例如钢材的再结晶退火，是在再结晶温度区间加热。

退火温度为引物和模板结合时候的温度参数，当百分之五十的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，它是影响PCR特异性的较重要因素，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合，合理的退火温度从554度到70度，由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。