甲基橙变色规律是：在中性或碱性溶液中是以磺酸钠盐的形式存在，在酸性溶液中转化为磺酸，这样酸性的磺酸基就与分子内的碱性二甲氨基形成对二甲氨基苯基偶氮苯磺酸的内盐型式（成对醌结构），成为一个含有对位醌式结构的共轭体系，所以颜色随之改变。
甲基橙在分析化学中是一种常用的酸碱滴定指示剂，不适用于作有机酸类化合物滴定的指示剂。其浓度为0.1%的水溶液pH为3.1（红）-4.4（黄），适用于强酸与强碱、弱碱间的滴定。还用于分光光度测定氯、溴和溴离子，并用于生物染色等。
甲基橙曾在实验室和工农业生产中用作化学反应的酸碱度控制，以及化工产品和中间体的酸碱滴定分析。